一、原代培养及其操作步骤
原代分离细胞培养就是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度与一定得营养条件下，生存、生长与繁殖。原代培养细胞常有不同得细胞成分,生长缓慢,但就是更能代表所来源得组织细胞类型与表达组织得特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验,如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。
1、剪切组织 先将所取得得组织，用D－Haｎｋｓ或Hankｓ液清洗,以去除表面血污，并用手术镊去除黏附得结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块,移入青霉素小瓶或小烧杯中,加入适量缓冲液,用弯头眼科剪,反复剪切组织,直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后,用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2、消化分离 消化分离得目得就是将细小得组织块消化分离成细胞团或分散得单个细胞,以利于进一步得培养,常用得消化酶有胰蛋白酶与胶原酶。
３、培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～５)×105 cellｓ/ｍl，或实验所需密度,分装于培养瓶中,使细胞悬液得量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CＯ２培养箱内,5％CＯ2,37℃静置培养。一般3～5d,原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长,可补加原培养液量1/２的新培养液,继续培养2～3d后换液,一般7～１４d可以长满瓶壁,进行传代。
4、注意事项
(１)无菌操作:细菌或霉菌污染就是培养失败的常见原因,必须加强各个环节的无菌操作观念,以预防为主,一旦污染,一般很难消除。
(2）培养液：所用得培养液必须满足细胞生存与生长得必要条件。由于细胞来源得动物种类、组织类型不同,对培养液得要求有一定得差异,必要时可用预实验得方法选择适当得培养液。
（3)小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存与促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家得某一批号小牛血清后,就保持应用至实验完成。
